01 背景

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）属于转化生长因子（TGF-β）超家族成员，BMPs家族成员至少有40个，如：BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-7等。Marshall Urist等于1965年首次提出，1972年定义，并于1982年首次从脱钙骨中分离鉴定。研究结果表明，BMPs涉及到几乎所有器官和组织的生长发育，其中BMP2在骨缺损修复方向，诱导成骨的能力已经深入人心，而且BMP一般无物种特异性，跨物种诱导能力显著，因此其在临床上的应用前景非常可观。

02 生理机制研究进展

骨缺损修复领域对材料和药物的需求日益旺盛，材料的创新非常困难，促进修复的药物成为了研究者解决问题的另外一种角度。从提出BMP蛋白之后，对其研究便进入了白热化的阶段，其基本基因结构和作用机制已有较大进展。BMPs家族成员被分为5个亚型，其中，BMP2与骨的生长和分化相关，是目前最强的促进骨修复的骨形态发生蛋白，属于第一亚型。

BMP2基因由3个外显子和2个内含子组成，且不同物种BMP2基因编码区序列同源性较高。BMP2蛋白属于疏水性蛋白，具备生物活性的蛋白主要是由成熟区与自身或者其他BMP蛋白形成的二聚体，二聚体包含了2个通过二硫键共价链接的114肽亚单位。

BMP蛋白家族在骨修复中主要是通过自身介导和协同调控两种途径，其中自身介导是通过 TGF-β 超家族的 I 型受体和 II 型受体传递信号发挥生物学功能，BMP蛋白分泌后，BMP 配体与 II 型受体结合并磷酸化 I 型受体，随后再磷酸化下游转录因子，形成复合物并转移到细胞核，启动相关基因转录，从而调节细胞的增殖和分化等生命活动。

在 C2C12 间充质干细胞中发现 Runx2 上游因子 p38 被 BMP2 激活，使 Runx2 的表达上调，促进间充质前体细胞的分化。将原代小鼠颅源性成骨细胞在 BMP2 培养基中诱导培养，并抑制 p38 的表达，碱性磷酸酶活性也会降低；抑制氨基末端激酶（JNK）的表达，骨钙素的表达明显下调，从而影响骨分化。此外，Yang 等研究发现，BMP-2 磷酸化 JNK，可以增强成骨细胞分化。

BMP蛋白与其他因子协同调控骨生长的机制主要体现在如下一些研究中，在颅骨缺损模型中发现，胞外钙离子可增强 BMP-2 对 Smad 信号通路的磷酸化，使骨钙素、成骨特异性转录因子(Runt-related Transcription Factor2，Runx2) 和成骨相关转录因子(Osterix，Osx)的表达上调，促进了体内骨再生。Chio 等在大鼠骨质疏松症体内模型中观察到维生素 C 使 BMP2 的表达增强，抑制大鼠骨质疏松症的发生。Kovermann 等研究表明，含有 BMP2 的体外培养基能够诱导人滑膜源性干细胞形成软骨，在含有 TGF-β1 和 BMP2 的联合培养基中与软骨形成相关的聚蛋白多糖(Aggrecan， ACAN)的表达也显著上调，促进软骨形成。此外，BMP2/7 异二聚体蛋白联合低浓度的全反式维甲酸 (All-Trans Retinoic-Acid，ATRA)可使小鼠骨髓源巨噬细胞中破骨细胞生成相关基因的表达下调，阻断破骨细胞生成并降低破骨细胞的吸收活性。综上，BMP蛋白不仅能单独调控干细胞的成骨和成软骨定向分化，而且还可以协同其他因子形成调控骨发生的网络。深入的机制研究，为BMP蛋白在临床中的应用提供了可靠的保障。

03 表达工艺研究进展

BMP2蛋白在成骨研究中是最多的，也是成骨效果最佳的，已经有研究证实，对成骨细胞、软骨细胞的分化及功能具有重要的调节作用。目前已经有多种合成路线，已有多家医疗器械生产企业成功制备了rhBMP2。

1、表达载体构建：

进行BMP2蛋白氨基酸序列检索，合成基因序列。将合成产物与质粒载体双酶切后，利用T4-链接酶转接，转化大肠杆菌克隆菌株，提取重组质粒双酶切后，转化入大肠杆菌表达菌株，构建重组蛋白的表达菌株。

2、重组蛋白的表达检测与纯化：

将重组菌株过夜培养，以 1 ∶ 100 倍转接入新鲜的 LB 培养基中， 待 OD600 约 0. 5 时，加入终浓度 0. 5 mmol/L IPTG， 37 °C 诱导培养 5 h，收集菌体，蛋白电泳检测 BMP2 表达情况。

3、重组蛋白纯化：

取上清液用超滤管浓缩提纯，将浓缩蛋白进行阴离子交换层析，用 20 mmol/L Tris-HCl缓冲液冲洗。用20mmol/L Tris-HCl和不同浓度 NaCl混合液分3次洗脱。每次洗脱过程中，NaCl浓度依次设置为 100，50，10 mmol/L。

4、BMP2 蛋白序列系统发生分析：

根据 NCBI 数据库公布的 BMP2 蛋白氨基酸序列，利用 DNA- MAN 软件进行同源性分析；通过 MEGA 5. 02 软件， 并采用 Neighbour-Joining 方法构建系统发生树。

5、重组蛋白活性测定：

复苏间充质干细胞，将培养细胞接种到96孔板中，每孔接种1万个细胞。将磷酸缓冲盐溶液、标准蛋白样品、纯化重组蛋白样品分别加入到培养孔中，置于CO2 培养箱中培养36~48h；向样品孔中加入10μL CCK-8试剂，轻微震荡混匀，在CO2 培养箱中培养2~4h，利用酶标仪检测样品D(450)值。

04 BMP蛋白应用现状

目前在科研用途方面，已经有数家国内外企业能够成功高效合成BMP2蛋白，在鉴定环节，对应单抗的合成技术也是很成熟。但是临床的使用却比较坎坷，2002年，美敦力的Infuse（BMP-2），史赛克的OP-1Implant、OP-1Putty以及Osigraft通过了FDA批准。不过，这项批准仅仅是为了将其作为传统脊柱融合术的替代治疗手段。通常使用这款脊柱植骨替代材料致使其骨细胞过度增生，环绕脊柱造成神经压迫，给大量患者造成不可逆的伤害。

国内正海生物、九源基因、瑞邦生物通过特殊技术和载体结合rhBMP-2，改良生物相容性、修复因子的缓释、活性和吸收等情况。本土企业已然做了很多基础研究来控制BMP2含量，解决骨质过度增生的情况，相应产品已经获批上市，如：骨优导、活性生物骨、自固化磷酸钙人工骨。

05 总结

BMP蛋白对无法愈合的骨损伤、骨不连，以及遗传性骨缺损具有良好的治愈作用。给临床骨缺损修复带来了一线曙光，随着基础研究和体外表达系统的不断深入，人源化重组蛋白rhBMP工业化已经实现。但是临床上也相应反应出了诸多并发症，如：局部肿胀、骨质增生、呼吸困难等。这是需要进一步临床实验来确定其剂量与安全性之间的平衡关系，同时还存在的一个缺陷即为其半衰期短，在体内易降解，因此需多采取缓释技术局部用药，延缓其衰解。譬如脂质体包埋、与合成材料耦链或者微孔封闭技术等，结合现代的组织工程和3D打印技术，让rhBMP可以有效的减少局部使用浓度，达到促进骨形成、减少并发症的效果。

参考文献

【1】Kovermann N J, Basoli V, Della Bella E, et al. BMP2 and TGF- beta cooperate differently during Synovial-Derived Stem-Cell Chondrogenesis in a dexamethasone-dependent manner[J]. Cells, 2019, 8(6): 636.

【2】Choi H K, Kim G J, Yoo H S, et al.Vitamin C activates osteo- blastogenesis and inhibits osteoclastogenesis via Wnt/beta- Catenin/ATF4 signaling pathways[J]. Nutrients, 2019, 11(3):506. 

【3】Bi W, Liu Y, Guo J, et al. All-trans retinoic-acid inhibits heterodimeric bone morphogenetic protein 2/7-stimulated osteoclastogenesis, and resorption activity[J]. Cell Biosci, 2018, 8: 48.

【4】Aquino-Martinez R, Artigas N, Gamez B, et al. Extracellular calcium promotes bone formation from bone marrow mesench- ymal stem cells by amplifying the effects of BMP-2 on SMAD signalling[J]. PLoS One, 2017, 12(5): e0178158.

【5】Chiu R, Angel P, Karin M. Both the Smad and p38 MAPK pathways play a crucial role in Runx2 expression following induction by transforming growth factor-|[beta]| and bone morphogenetic protein[J]. Oncogene, 2002, 21(47): 7156-7163.

【6】Huang Y F, Lin J J, Lin C H, et al. c-Jun N-terminal kinase 1 negatively regulates osteoblastic differentiation induced by BMP2 via phosphorylation of Runx2 at Ser104[J]. J Bone Miner Res, 2012, 27(5):1093-1105.

【7】Yang J, Ye L, Hui T Q, et al. Bone morphogenetic protein 2-induced human dental pulp cell differentiation involves p38 mitogen-activated protein kinase-activated canonical WNT pathway[J]. Int J Oral Sci, 2015, 7(2): 95-102.

【8】赵卓，籍昊天，肖业臣。BMP4重组蛋白在毕赤酵母中表达载体构建与纯化分析。东北师大学报，2022

【9】刘祥。小鼠骨形成蛋白BMP3的原核表达及多克隆抗体制备与鉴定。华北农学报，2015

【10】刘启省，张东刚，南南等。骨形态发生蛋白-2单克隆抗体的制备及评价。药物分析杂志，2018

【11】费晓娟，金美林，卢赠奎，狄冉，魏彩虹。骨形态发生蛋白-2（BMP2）基因的生理功能和信号通路研究进展。中国畜牧杂志，2021